現(xiàn)代生物技術(shù)特別是轉(zhuǎn)基因技術(shù)有效縮短了育種時(shí)間，克服了一些農(nóng)藝學(xué)的問(wèn)題和環(huán)境問(wèn)題，這些問(wèn)題通過(guò)傳統(tǒng)的方法無(wú)法解決。利用生物技術(shù)的方法，如通過(guò)組織培養(yǎng)擴(kuò)大月季繁殖，通過(guò)體細(xì)胞無(wú)性系的變異及遺傳物質(zhì)的轉(zhuǎn)化，豐富月季的染色體組，本文就這方面的問(wèn)題進(jìn)行了綜述。 一、引言 植物組織培養(yǎng)技術(shù)在園藝上的較好個(gè)有效利用是1920年在實(shí)驗(yàn)室條件下誘導(dǎo)蘭花種子萌發(fā)。植物組織培養(yǎng)在栽培植物的大面積商業(yè)應(yīng)用出現(xiàn)在30年前。與草本植物相比，木本植物僅有150多個(gè)應(yīng)用比較廣泛的種類(lèi)被成功擴(kuò)繁。月季作為商業(yè)切花作物之一，常常通過(guò)芽接的方法進(jìn)行繁殖。月季的育種目標(biāo)是提高各項(xiàng)生物學(xué)特性以增強(qiáng)其觀賞價(jià)值，包括花的顏色、大小、形狀、開(kāi)花持續(xù)時(shí)間及對(duì)環(huán)境的適合性。盡管理想的特性被經(jīng)典育種所采用，但仍有一些因素限制了這一方法。 首先是基因庫(kù)的限制；第二是不親和性染色體倍性的差異限制了遠(yuǎn)緣雜交；第三，某些特性如生長(zhǎng)的均勻性和開(kāi)花是受多基因控制的。各種因素巧妙的平衡決定了植物的生長(zhǎng)和發(fā)育。這種平衡將被有性雜交和篩選所改變。可以設(shè)法用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的方法和其它生物技術(shù)方法來(lái)建立轉(zhuǎn)化體系。細(xì)胞生物學(xué)和分子生物學(xué)的發(fā)展為開(kāi)發(fā)新的種質(zhì)資源提供了機(jī)會(huì)，這種種質(zhì)資源可以滿(mǎn)足變異的需要。 月季基因工程戰(zhàn)略是有價(jià)值的，因?yàn)樗龠M(jìn)了單個(gè)基因的改變而不會(huì)破壞原有的特性所表現(xiàn)的商業(yè)價(jià)值。轉(zhuǎn)基因在月季方面的應(yīng)用有很大的潛力。可以提高抗病蟲(chóng)能力，改善花色、形態(tài)結(jié)構(gòu)和瓶插壽命。月季野生種和栽培種的鑒定可以通過(guò)各種分子標(biāo)記（RLFP和RAPD）和同工酶技術(shù)進(jìn)行。月季擴(kuò)繁方面的廣泛研究使我們對(duì)擴(kuò)繁有了一個(gè)全新的認(rèn)識(shí)，近年來(lái)生物技術(shù)的應(yīng)用給月季研究的各方面提供了有利條件。 二、月季育種薔薇屬是一個(gè)非常大的家族，確切的種類(lèi)和數(shù)目目前還不清楚，我們現(xiàn)在的月季已經(jīng)經(jīng)過(guò)了幾個(gè)世紀(jì)的人工雜交和自然變異的歷史過(guò)程。大部分栽培月季分布在北半球的溫帶，亞洲是其基因中心，大多數(shù)的種在亞洲被發(fā)現(xiàn)。月季的染色體數(shù)目從2n=2X=14到2 n=8X=56，大多數(shù)是二倍體或是四倍體，商業(yè)性種植的栽培通常是三倍體或四倍體。育種家對(duì)月季突變表現(xiàn)出很大的興趣，頻繁發(fā)生的自然突變加大了遺傳物質(zhì)的變化。 Jacobs等1970年報(bào)告了離體技術(shù)在突變體的繁殖方面的應(yīng)用。從 1937年到1976年，發(fā)現(xiàn)865種月季是通過(guò)自然突變產(chǎn)生的，289種具有攀緣性。月季類(lèi)別不同突變頻率也不同。因此，研究突變基因的遺傳很有意義。已經(jīng)發(fā)表的月季突變育種方面的文章很多，James（1983 ）報(bào)告了兩個(gè)誘導(dǎo)突變體，波拉（Paula）來(lái)自栽培品種伊麗莎白皇后（Queen Elizabeth），粉紅帽子（Pink Hat）來(lái)自不知名的薔薇。它們是通過(guò)γ射線(xiàn)照射正在生長(zhǎng)的頂芽而獲得的。Ｂｅｎｅｔｋａ于１９８５年分別用０、２０、３０、４０和６０ＧＹγ射線(xiàn)照射切下的單芽，觀察了４代，他發(fā)現(xiàn)４０－５０ＧＹ是較佳處理。Ｗａｌｔｈｅｒ和Ｓａｕｅｒ（１９８６）用離體技術(shù)，通過(guò)用Ｘ射線(xiàn)處理來(lái)增加植物的變異性。 三、無(wú)菌培養(yǎng)的建立 對(duì)離體培養(yǎng)來(lái)說(shuō)，弄清植物的生理狀態(tài)及對(duì)不同病原菌的敏感性是非常必要的。通常大多數(shù)外植體要用5-10%的去垢劑溶液洗20分鐘，也可用0.1%HgCl2 殺菌20-25分鐘，接著用蒸餾水沖洗2-5次，再轉(zhuǎn)到M S（Murashige and Skoog 1962）培養(yǎng)基上或木本植物培養(yǎng)基（Loyd and Macown 1981）或B5培養(yǎng)基（Gamgorg et al 1968），再補(bǔ)充不同濃度的生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑。較初的外植體必須先用20%的酒精處理20-30 秒，接著用0.1%HgCl2處理，然后用無(wú)菌蒸餾水沖洗。在某些情況下，剛開(kāi)始培養(yǎng)幾個(gè)月后，從外植體切口末端會(huì)分泌出乳白色的內(nèi)部污染物。 四、防止培養(yǎng)基氧化當(dāng)外植體在培養(yǎng)基上培養(yǎng)時(shí)，會(huì)出現(xiàn)兩個(gè)主要問(wèn)題，其中之一是褐變，它被認(rèn)為是從外植體切口處流出的多酚氧化酶被氧化的結(jié)果，褐變可以通過(guò)加入諸如PVP（聚乙稀吡咯）、檸檬酸或抗壞血酸阻止氧化而克服，也可以接種后在黑暗中培養(yǎng)1-2天，因?yàn)槿藗儼l(fā)現(xiàn)光能影響多酚氧化酶的活性。在大多數(shù)情況下，每6-7天要把外植體轉(zhuǎn)移到新鮮培養(yǎng)基上，通過(guò)反復(fù)的再培養(yǎng)，褐變問(wèn)題就能解決。 五、增殖方法 Mar和Zieslin（1987）論述了生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑在月季增殖方面的作用，每一個(gè)頂端或葉腋的分生組織都有發(fā)育成具有自然分枝系統(tǒng)的主枝的能力，并且具有無(wú)限增殖的潛能。不定芽是特定的愈傷組織細(xì)胞發(fā)育產(chǎn)生的。愈傷組織是修剪或受傷引起的傷害反應(yīng)。 １．分生組織培養(yǎng) 2.愈傷組織培養(yǎng)和植株再生 3.花藥培養(yǎng) 4.原生質(zhì)體培養(yǎng) 5.花粉培養(yǎng) 6.懸浮培養(yǎng) 六、根的發(fā)育 在離體下，由正常生長(zhǎng)的幼芽成功進(jìn)行根的誘導(dǎo)，究竟是直接在綜合培養(yǎng)基上進(jìn)行，還是在去掉CTK的培養(yǎng)基上進(jìn)行，取決于種和品種，生根能力還取決于內(nèi)部物質(zhì)的互相作用及外部因素。Skirvin和Chu(1 979)在不加生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑的固體培養(yǎng)基上用月季的再生幼芽誘導(dǎo)生根。許多學(xué)者報(bào)告在外加低濃度生長(zhǎng)素（IAA或IBA或NAA）0.1-0.5毫克/升范圍內(nèi)，并降低蔗糖濃度可以很容易地從切下的成熟幼芽上誘導(dǎo)生根。 Savies（1980）在幾個(gè)栽培品種的月季上用外加40g/L蔗糖，不加生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑的MS培養(yǎng)基上生根，成熟率達(dá)100%，Khosh-Khui和Sink（19 82）報(bào)告了不同濃度的生長(zhǎng)素混合物，在不同溫度和光照下對(duì)月季婚禮粉生根的影響，他們認(rèn)為，IAA（0.0-0.1毫克/升）和NAA(0.0-0.1 毫克/升)對(duì)誘導(dǎo)生根是有效的，不同濃度的鹽、生長(zhǎng)素、庶糖、瓊脂及pH值和不同光周期對(duì)月季根發(fā)育的影響已經(jīng)有了大量的研究，但培養(yǎng)環(huán)境如溫度和光照對(duì)生根影響方面的報(bào)告很少。 Khosh-Khai和Sink(1982b.c)在大約1.0klax光照度下使80%的婚禮粉成功生根，他們觀察到高光照度(3.0klax)會(huì)抑制生根，另一方面，他們注意到培養(yǎng)箱中，不論光照度為多少，培養(yǎng)瓶陰涼的低位部分微小幼芽的生根較好。Bresson等（1982）報(bào)告每天12-24小時(shí)17mmol / m2.s的光通量密度對(duì)開(kāi)始生根是較適宜的。 Skirvin和chu（1984）和Skirvin等（1984）發(fā)現(xiàn)紅光對(duì)微型月季的生根有利，他們還用離體的雜種月季增輝（Improved Blaze）已經(jīng)發(fā)育的幼芽，通過(guò)降低MS培養(yǎng)基的鹽濃度（6.0-7.5毫米）成功誘導(dǎo)生根。把幼芽末端在1毫米IAA的溶液中浸幾個(gè)小時(shí)，以代替含有生長(zhǎng)素的培養(yǎng)基，也能成功誘導(dǎo)生根。 Khosh-Khui和Sink（1982）報(bào)告1/2MS培養(yǎng)基外加NAA（0.54微摩爾/升）可以使雜種月季新娘的面紗（Brida Veil）誘導(dǎo)生根。Sauer 等（1985）報(bào)告10個(gè)不同品種的月季在1/3濃度的MS培養(yǎng)基上外加5.7 微摩爾/升的IAA，在10-14天內(nèi)生根。隨后，Douglas等（1989）用伊麗莎白皇后幼芽（大于2mm）在稀釋到1/4濃度的MS培養(yǎng)基上，在沒(méi)有生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑的情況下成功獲得了非常高的生根率。 Rout等（1990）報(bào)告了7個(gè)不同的月季品種在1/2MS培養(yǎng)基上外加 0.1-0.25毫克/升NAA或2，4-D或二者混合物，8-10天內(nèi)的生根情況，涉及的雜種月季品種有蘭道爾（Landorn）、伊麗莎白皇后，處女座（ Virgo），超級(jí)巨星（Super star）、海珍珠（Sea pearl）、幸福（Happiness），其生根率分別為90.9%、87.5%、92.0%、99.2%、86.2 %和83.9%。經(jīng)過(guò)8-10天的培養(yǎng)，微小幼芽的生根在固體培養(yǎng)基中比在液體培養(yǎng)基中好，生根與微小幼芽的芽齡和大小有關(guān)。Rount比較了3 個(gè)處理對(duì)6個(gè)雜種月季品種的生根反應(yīng)，幼芽長(zhǎng)度和芽齡分別為0.5-1 .0厘米4周、1.5-2.0厘米6周、2.0-2.5厘米8周。生根率較高的（92 -98%）是6周齡1.5-2.0厘米長(zhǎng)的幼芽，放在IBA（1.0毫克/升）的溶液中浸15-20分鐘后在無(wú)菌營(yíng)養(yǎng)基上培養(yǎng)。Amold等（1995）報(bào)告用朝鮮月季約翰富蘭克林(John Franklin)和冠軍（Champlain）的幼芽在低濃度或缺少生長(zhǎng)素及高鹽濃度的培養(yǎng)基上生根良好，冠軍生根較適宜的條件是在高IAA濃度下，降低鹽濃度和IBA及NAA濃度。月季和平的離體幼芽在外加0.5毫克/升IBA的1/2MS的培養(yǎng)基上生根良好。 七、體細(xì)胞的胚體形成在離體增殖的方法中，通過(guò)體細(xì)胞的胚體形成給無(wú)性系的增殖提供了巨大潛力，因?yàn)閱蝹�(gè)的細(xì)胞能誘導(dǎo)產(chǎn)生一個(gè)胚體較后形成完整植株。許多研究人員用月季的葉子、節(jié)間、雄蕊的花絲、根和受精的胚使體細(xì)胞的胚體形成獲得成功。Wit等用栽培品種多米格（Domingo）、備用鑰匙（Vic key）、褐色（Brown）的葉作外植體，在1/2MS培養(yǎng)基上外加0.1×10-6激動(dòng)素和0.05×10-6NAA培養(yǎng)了6-12周，觀察體細(xì)胞體。Rount等（1991）報(bào)告胚體發(fā)生的誘導(dǎo)及其后來(lái)的發(fā)育，愈傷組織用栽培月季品種南道爾末成熟的葉和莖段產(chǎn)生的愈傷組織，用1/2MS培養(yǎng)基外加2.2微摩爾/升BA，0.05微摩爾/ 升NAA，0.3微摩爾/升GA3和200-800毫克 / 升的脯氨酸。玫瑰（Rosa Rugosa）未成熟的種子在沒(méi)有生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑的MS培養(yǎng)基上能誘導(dǎo)胚體的形成。DAS等（1993）觀察到體細(xì)胞胚體形成的誘導(dǎo)依靠碳水化合物的類(lèi)型和組成。體細(xì)胞胚體的較大產(chǎn)量在含有0.1摩爾/升果糖或蔗糖而缺乏生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑的培養(yǎng)基上獲得。Moyne等(1993)建立了與再生潛力有關(guān)的雜種月季胚體形成的細(xì)胞體系，他們還報(bào)告了在愈傷組織中，大多數(shù)細(xì)胞是4倍體。Das等（1993）觀察到在誘導(dǎo)培養(yǎng)基中加入麥芽糖（20克 / 升）能提高正常胚體的產(chǎn)量。Salm等（1996）報(bào)告了月季黃金大道（Money Way）體細(xì)胞胚體的形成和幼芽再生，培養(yǎng)基用的是無(wú)激素的SH（Schenk and Hildebrand 1972）培養(yǎng)基外加500毫克/ 升水解態(tài)的酪蛋白、87毫克/升蔗糖、1000毫克/升肌醇、100毫克/升脯氨酸、5毫克/升煙酸、0.5毫克/升吡哆鹽酸，5毫克/升硫胺鹽酸。 在加有2.2微摩爾/升BA，0.05微摩爾/升NAA，0.05微摩爾/升GA3 的培養(yǎng)基每4周一個(gè)間隔對(duì)胚體形成的愈傷組織團(tuán)進(jìn)行再培養(yǎng)，能誘導(dǎo)出體細(xì)胞胚體次生物，且能長(zhǎng)期保持（16個(gè)月），在培養(yǎng)基中加入2， 4-D有助于愈傷組織長(zhǎng)期保存。Kunitake等注意到受精的胚有能力使體細(xì)胞胚體在沒(méi)有外源生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑的培養(yǎng)基上正常發(fā)育，但這個(gè)胚體形成在6個(gè)月以后不再持續(xù)。Rout等在蘭道爾的愈傷組織培養(yǎng)中報(bào)告了體細(xì)胞胚體形成和再生的發(fā)育順序。 胚的發(fā)育和體細(xì)胞胚體的萌芽是形成植株的前提。關(guān)于月季栽培品種有許多報(bào)告表明，省略或降低培養(yǎng)基中2，4-D的濃度有利于胚的發(fā)育和萌芽。Mathews等（1991）報(bào)告在雜種月季中有30%的體細(xì)胞胚體在轉(zhuǎn)到無(wú)激素的SH培養(yǎng)基上后，能萌芽形成新的植株。Noriega和S ondahl（1991）及Roberts等（1990）報(bào)告在培養(yǎng)基中加入ABA和GA3 有助于胚的發(fā)育。Rount等（1991）報(bào)告在初培養(yǎng)時(shí)加入脯氨酸，利用它在再生培養(yǎng)基中的排斥作用，可刺激胚發(fā)育，降低發(fā)育異常的頻率。他們還報(bào)告在1/2MS培養(yǎng)基上外加0.5毫克/升BA，0.1摩爾/升GA3和1. 5毫克/升硫酸腺嘌呤，在8℃下培養(yǎng)4天能使萌芽率從0提高到12%。Ro berts等（1995）報(bào)告在4℃以下培養(yǎng)2周，能使萌芽率從12%提高到24 %。Kunitake等（1993）報(bào)告在含有0.1摩爾/升山梨糖醇而沒(méi)有生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑的培養(yǎng)基上，用玫瑰的體細(xì)胞胚芽形成了新的植株。 八、煉苗和大田移栽 九、離體培養(yǎng)中無(wú)性系的穩(wěn)定性 十、遺傳物質(zhì)的轉(zhuǎn)化 十一、結(jié)論 本文總結(jié)了月季生物技術(shù)方面的研究進(jìn)展。影響月季擴(kuò)繁的因素很多，無(wú)論直接用沒(méi)有形成愈傷組織的外植體還是間接地用有生長(zhǎng)潛能的外植體，都能使不同種或品種的月季離體的不定幼芽再生。體細(xì)胞胚體的形成給體細(xì)胞雜交、冷凍保存和基因轉(zhuǎn)化的研究提供了條件。植物細(xì)胞基因控制方面的較新進(jìn)展為月季的研究打開(kāi)了新的思路。把外源基因轉(zhuǎn)移到植物體中主要依靠離體再生系統(tǒng)的再生效率�；蜣D(zhuǎn)化可以通過(guò)許多方法實(shí)現(xiàn)，包括通過(guò)顯微注射把DNA直接插進(jìn)原生質(zhì)體。但較重要的突破是基因槍的出現(xiàn)�；驑屖峭ㄟ^(guò)表面涂有DNA的鎢或金的微粒轟擊再生組織。在轉(zhuǎn)基因月季發(fā)育的早期可以用DAN隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性（RAPD）、擴(kuò)增片段長(zhǎng)度多態(tài)性（AFLP）、限制酶片段長(zhǎng)度多態(tài)性（RFLP）等分子標(biāo)記的方法進(jìn)行檢測(cè)，以觀測(cè)遺傳物質(zhì)的變化。研究人員Marchant等（1998a）用遺傳轉(zhuǎn)化技術(shù)使轉(zhuǎn)基因月季的再生獲得成功。Marchant等（1998b）報(bào)告幾丁質(zhì)轉(zhuǎn)基因在控制月季黑斑病方面的表達(dá)，他們表示抗病基因轉(zhuǎn)入月季能提高觀賞植物的價(jià)值。 離體培養(yǎng)技術(shù)和其他生物技術(shù)在提高月季抗病蟲(chóng)性、花色、形態(tài)和瓶插壽命方面有重要作用。單倍體離體培養(yǎng)將有助于產(chǎn)生純合體，胚培養(yǎng)有助于多種月季的雜交，提高產(chǎn)量和繁殖系數(shù)。這些技術(shù)有助于我們認(rèn)識(shí)月季基本的遺傳物質(zhì)。另外，把月季作用木本植物生物技術(shù)的模式物種，在研究染色體倍性方面有重要作用，因?yàn)樵录竞薉NA數(shù)量少，完成開(kāi)花的周期短，種子產(chǎn)量較高，有大量的可供利用的栽培品種。