安平縣麒麟金屬網(wǎng)廠
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植物組織培養(yǎng)的技術(shù)原理
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非洲菊也可以通過(guò)組培快繁技術(shù)進(jìn)行繁殖
植物組織培養(yǎng)脫毒的原理主要是利用莖尖分生組織不帶毒或少帶毒。感病植株體內(nèi)的病毒分布不均勻，其數(shù)量隨植株部位和年齡而異，越靠近莖尖頂端的區(qū)域，病毒的濃度也越低。分生區(qū)域無(wú)維管束，病毒只能通過(guò)胞間連絲傳遞，趕不上細(xì)胞不斷分裂和活躍的生長(zhǎng)速度，因此生長(zhǎng)點(diǎn)含有病毒的數(shù)量極少，幾乎檢測(cè)不出病毒。因此，莖尖培養(yǎng)時(shí)，切取莖尖的大小對(duì)脫毒效果有很大影響，莖尖越小效果越佳，但太小時(shí)不易成活，過(guò)大則不能保證完全除去病毒。不同種類的植物和不同種類的病毒在莖尖培養(yǎng)時(shí)切取的莖尖大小也不相同。一般來(lái)說(shuō)，切取0.2至0.5毫米帶1至2個(gè)葉原基的莖尖進(jìn)行培養(yǎng)即可。
3.保存種質(zhì)資源常規(guī)有性繁殖往往會(huì)造成大小不一的變異，如紅色可能變異成粉紅色等。組織培養(yǎng)不存在變異，可保持原母本的一切遺傳特性，防止種質(zhì)資源的退化。很多無(wú)性繁殖的植物因沒(méi)有種子，無(wú)法長(zhǎng)期保存，其種質(zhì)資源傳統(tǒng)上只能在田間種植保存，耗費(fèi)人力物力，且資源易受人為因素和環(huán)境因素影響而丟失。而用組培方法保存，可大大節(jié)省人力、物力，并延長(zhǎng)保存期，保證種質(zhì)資源不會(huì)突變和流失。
4.花卉育種在花卉育種上，主要在胚胎培養(yǎng)、單倍體育種、體細(xì)胞雜交和植物基因工程等方面應(yīng)用較多，此外還可采用愈傷組織誘變、花粉培養(yǎng)等多種方法來(lái)進(jìn)行花卉育種。通過(guò)組織培養(yǎng)，可縮短育種年限和世代，也有利于基因突變中隱性突變的分離。利用組織培養(yǎng)技術(shù)可以對(duì)花粉和花藥進(jìn)行培養(yǎng)，得到單倍體植株，從而縮短了育種周期，尤其是對(duì)木本的花卉育種特別有意義。
�。�1）無(wú)性系變異的利用植物細(xì)胞或原生質(zhì)體經(jīng)愈傷組織誘導(dǎo)再生植株的過(guò)程中，可能伴隨著廣泛的變異，這種變異稱為體細(xì)胞無(wú)性系變異。植物體細(xì)胞無(wú)性系變異是遺傳變異的重要來(lái)源之一，它具有變異廣泛、后代較穩(wěn)定、基本保持原品種特性等優(yōu)點(diǎn)。
（2）遠(yuǎn)緣雜交種后代的獲得百合、鳶尾等許多花卉雖然可以進(jìn)行遠(yuǎn)緣雜交，但是由于生理代謝等方面的原因，常使雜種胚早期敗育，因而得不到雜種植物。而在試管中進(jìn)行胚培養(yǎng)，可使其順利生長(zhǎng)，得到遠(yuǎn)緣雜種。
�。�3）草花育種組織培養(yǎng)是應(yīng)用較早，比較成熟的一項(xiàng)技術(shù)，在草花育種中主要用作其他育種手段的輔助技術(shù)。例如，當(dāng)某一變異植株上具有優(yōu)良性狀而尚未確定該性狀能否遺傳時(shí)，可用莖尖組培技術(shù)擴(kuò)繁，增加供試材料，防止有益變異的組織丟失。另外，誘導(dǎo)胚狀體過(guò)程中常產(chǎn)生變異，因而組培也是一種引發(fā)變異的育種手段。同時(shí)，細(xì)胞在離體培養(yǎng)過(guò)程中會(huì)產(chǎn)生廣泛的無(wú)性系變異，通過(guò)協(xié)迫培養(yǎng)，可以獲得具有相應(yīng)耐性的愈傷組織，誘導(dǎo)產(chǎn)生再生體植株，從而獲得耐性遺傳。
（4）花卉品種的提純復(fù)壯運(yùn)用組織培養(yǎng)，苗木的復(fù)壯過(guò)程很明顯，對(duì)于長(zhǎng)期運(yùn)用無(wú)性方法繁殖并開(kāi)始退化的花卉品種，如康乃馨采用組培方法繁殖，可使個(gè)體發(fā)育向年輕階段轉(zhuǎn)化。
二、花卉組織培養(yǎng)的途徑
1.生長(zhǎng)點(diǎn)途徑通過(guò)誘導(dǎo)莖尖或側(cè)芽，形成大量腋芽，從而獲得大量幼小植株。此途徑產(chǎn)生變異的機(jī)會(huì)較小，所獲瓶苗的品質(zhì)也較均勻。多數(shù)花卉植物的組培苗都采用這一途徑進(jìn)行快速繁殖。
2.胚狀體途徑通過(guò)誘導(dǎo)植物體細(xì)胞或組織產(chǎn)生胚狀體，再由胚狀體發(fā)育成大量植株。此途徑較易產(chǎn)生變異。一品紅、蘇鐵等通常采用此途徑進(jìn)行繁育。
3.愈傷組織途徑外植體經(jīng)植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑處理后先形成愈傷組織，再經(jīng)器官分化形成許多芽體，達(dá)到大量繁殖的目的。此途徑產(chǎn)生變異的機(jī)會(huì)比其他兩種途徑都大。
三、組織培養(yǎng)對(duì)實(shí)驗(yàn)室的要求花卉組織培養(yǎng)是在人工控制的條件下培養(yǎng)花卉，是一種花卉現(xiàn)代工廠化生產(chǎn)新技術(shù)，所以其對(duì)實(shí)驗(yàn)室及設(shè)備有一定的要求。
1.實(shí)驗(yàn)室方面（1）化學(xué)實(shí)驗(yàn)室：主要承擔(dān)配制培養(yǎng)基的任務(wù)。要求具有各種化學(xué)藥品試劑、各種玻璃器皿、稱量天平等。
�。�2）準(zhǔn)備室：主要進(jìn)行玻璃器皿的洗滌，要求有上下水裝置。進(jìn)行培養(yǎng)基礎(chǔ)用具的消毒。要有高壓滅菌鍋，具有水源和電源。
（3）接種室：是花卉材料分離、消毒接種和轉(zhuǎn)移的場(chǎng)所。要求密閉、清潔、整齊，裝有紫外燈，能隨時(shí)滅菌。
�。�4）培養(yǎng)室：是花卉材料培養(yǎng)生長(zhǎng)的地方。要求清潔、保溫好、室溫均勻一致，并有絕熱、防火性能。
為了保證接種室和培養(yǎng)室清潔無(wú)菌以及減少由于環(huán)境污染進(jìn)而導(dǎo)致培養(yǎng)基污染而造成的浪費(fèi)，建議較好安裝十萬(wàn)級(jí)的凈化設(shè)備，用物理滅菌手段代替化學(xué)滅菌，達(dá)到減少環(huán)境污染，實(shí)現(xiàn)可持續(xù)發(fā)展。
2.設(shè)備方面（1）天平：供配制培養(yǎng)基時(shí)稱量藥品和激素用。大量元素用普通天平；微量元素和激素用分析天平。
�。�2）酸度計(jì)：測(cè)定培養(yǎng)基的pH值。
�。�3）高壓滅菌鍋：用來(lái)供培養(yǎng)基和器械用具滅菌。
�。�4）烘箱：用于洗凈的玻璃器皿干燥滅菌。
�。�5）蒸餾水制造裝置：用來(lái)得到純凈水，供培養(yǎng)用。
�。�6）冰箱：供貯放母液和植物材料用。
�。�7）接種箱或超凈工作臺(tái)：為植物材料接種或轉(zhuǎn)移的操作場(chǎng)所。
�。�8）空調(diào)機(jī)：控制室溫用。四、花卉組織培養(yǎng)對(duì)培養(yǎng)基的要求培養(yǎng)基是花卉植物組織培養(yǎng)中十分重要的基質(zhì)，目前應(yīng)用的有很多種，但其主要成分大體相同。除主要成分是水外，其他還有大量元素、微量元素、維生素、生長(zhǎng)調(diào)節(jié)物質(zhì)、蔗糖和瓊脂等。
目前花卉組織培養(yǎng)中應(yīng)用較多的為MS培養(yǎng)基。其組成是在配制1升培養(yǎng)基時(shí)，加硝酸銨1.65克、硝酸鉀1.9克、氯化鈣0.44克、硫酸鎂0.37克、磷酸二氫鉀0.17克、碘化鉀0.83毫克、硼酸5.2毫克、硫酸鎂22.3毫克、硫酸鋅3.6毫克、鉑酸鈉0.25毫克、硫酸銅0.025毫克、氯化鈷0.025毫克、硫酸鐵27.8毫克、蔗糖20至40克和瓊脂4至10克。其他生長(zhǎng)調(diào)節(jié)物質(zhì)要根據(jù)花卉的種類和培養(yǎng)目的而確定。
配制培養(yǎng)基前要準(zhǔn)備好燒杯、量筒、吸管、容量瓶等玻璃儀器，預(yù)先稱好藥品用蒸餾水溶解，分別配制成10倍或100倍母液備用。配制培養(yǎng)基時(shí)準(zhǔn)備好培養(yǎng)瓶，可以是三角瓶也可以用目前市場(chǎng)上推出的塑料瓶、大燒杯、分液器等儀器，配制時(shí)先將瓊脂溶化，再加入各種母液和蔗糖，然后用1摩爾的氫氧化鈉或鹽酸調(diào)整培養(yǎng)基的pH值，一般掌握在5.8左右。以后可分注到培養(yǎng)瓶中，蓋好瓶蓋。培養(yǎng)基配好要經(jīng)高壓滅菌，冷卻后放到培養(yǎng)室預(yù)培養(yǎng)3天，如沒(méi)有雜菌污染，才可進(jìn)行花卉材料的接種。
五、組培法繁殖花卉的基本階段
1.外植體材料的選取從理論上講，越是具有全能性的部位其組培的成功性就越高。植物具有全能性的細(xì)胞通常有三類：一是受精卵；二是發(fā)育中的分生組織細(xì)胞，即分生組織、根尖、嫩莖、幼葉、花等；三是雌雄配子及單倍體細(xì)胞。
對(duì)大多數(shù)種子植物來(lái)說(shuō)，莖尖是較好的部位，但往往受到材料來(lái)源的限制，為此莖段也得到了徹底的應(yīng)用，而葉片的培養(yǎng)利用更為普遍，材料來(lái)源也較豐富。子葉和下胚軸的培養(yǎng)對(duì)于難培養(yǎng)的植物很有效，花粉和花藥培養(yǎng)則成為育種和脫毒苗獲取的重要途徑之一。
選材時(shí)應(yīng)注意選取帶菌少、生長(zhǎng)時(shí)間短、生長(zhǎng)旺盛的材料，還應(yīng)注意取材的時(shí)期。大多數(shù)植物應(yīng)在生長(zhǎng)開(kāi)始的季節(jié)進(jìn)行采樣，生長(zhǎng)末期或休眠期的外植體對(duì)誘導(dǎo)反應(yīng)遲飩。器官的狀態(tài)也有影響，沿花卉的主軸，越往上的部位經(jīng)組培形成的器官其生長(zhǎng)的時(shí)間越短且越易形成花器官；而下部組織產(chǎn)生營(yíng)養(yǎng)組織的比例較高。
2.材料的滅菌處理花卉植物組織培養(yǎng)即無(wú)菌培養(yǎng)，也就是要求培養(yǎng)的材料不帶有雜菌。從田間或溫室等地切取花卉材料時(shí)，應(yīng)選擇健壯無(wú)病蟲(chóng)母株，取幼嫩、分生能力強(qiáng)的部位，以利生長(zhǎng)。
取來(lái)的材料雖經(jīng)選擇，外部總還有不少雜菌。為此，接種前應(yīng)進(jìn)行表面滅菌。通常先用自來(lái)水沖洗十幾分鐘，把泥刷去。沖洗干凈后，用70％的酒精浸泡10至15秒鐘消毒。接著用無(wú)菌水（經(jīng)高壓滅菌的蒸餾水）沖洗兩次，再用10％的漂白粉澄清液浸泡20分鐘消毒或用0.1％的氯化汞浸泡3至15分鐘，較后用無(wú)菌水沖洗3至4次。帶有茸毛不易濕潤(rùn)消毒的材料可加些洗衣粉。上述操作皆應(yīng)在接種箱或超凈工作臺(tái)等無(wú)菌環(huán)境條件進(jìn)行。經(jīng)過(guò)表面滅菌的材料，用無(wú)菌濾紙將水吸掉，再用解剖刀切取所需部位，通常幾毫米大小即可。培育無(wú)病毒苗則應(yīng)在1毫米以下，然后用解剖針或槍式鑷子將材料接種到培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)。工具用完即應(yīng)在95％酒精中蘸一下，用干熱滅菌器或用火焰消毒法消毒，避免工具帶菌造成交叉污染。操作時(shí)應(yīng)穿工作服、戴工作帽，事先洗凈手，然后再用酒精棉擦拭一遍。
3.無(wú)菌培養(yǎng)體系的建立選擇健壯無(wú)病蟲(chóng)害的花卉植物母株，種植于室內(nèi)或溫室中經(jīng)過(guò)蒸汽消毒的培養(yǎng)基上，2至4周后，再?gòu)哪钢晟喜扇偵L(zhǎng)不久的莖頂或芽體（這些部位分生能力強(qiáng)且不易受污染）。莖頂或芽體以清水洗滌干凈后，先用70％（體積數(shù)，下同）的酒精表面消毒15至30秒，再用1.0克/升的升汞（HgCl 2）溶液（以浸沒(méi)莖頂或芽體為準(zhǔn)）消毒10分鐘左右，然后，再用無(wú)菌水沖洗5至7次。在超凈臺(tái)內(nèi)，先用無(wú)菌濾紙吸干莖頂或芽體表面的水分，然后摘取適當(dāng)大小的莖尖或芽體于誘芽培養(yǎng)基中培養(yǎng)。
誘芽培養(yǎng)基可采用基本培養(yǎng)基
MS，生根培養(yǎng)基可用1/2MS。激素可控制在6－BA（6－卞基腺嘌呤）1至5毫克/升，NAA（萘乙酸）0.1至0.5毫克/升范圍內(nèi)。誘芽、生根培養(yǎng)基附加的蔗糖量分別為30克/升和15克/升左右，瓊脂7至8克/升，pH值為5.7至5.8。培養(yǎng)溫度為23℃至27℃。光照時(shí)間每天為10至14小時(shí)，光照強(qiáng)度為1000至2000勒克斯。
4.叢生芽的分化及增殖篩選合適的培養(yǎng)基進(jìn)行芽分化及增殖培養(yǎng)，而后繼代培養(yǎng)，以使外植體在短期內(nèi)產(chǎn)生大量不定芽。
花卉材料接種后放到培養(yǎng)室培養(yǎng)。培養(yǎng)室是花卉材料培養(yǎng)生長(zhǎng)的場(chǎng)所，一般幾至十幾平方米皆可。高度約2米左右，空間小，可節(jié)省控溫能源。把培養(yǎng)材料放在培養(yǎng)架上培養(yǎng)。培養(yǎng)架可由木材或金屬制成，4至5層，每層高40至50厘米，常規(guī)方法是將日光燈裝在上方。架長(zhǎng)1.2米左右，與40瓦日光燈長(zhǎng)度一致，寬80至90厘米。每一層可裝2盞日光燈，這樣培養(yǎng)時(shí)的照度約為3000勒克斯。
目前市場(chǎng)上有一種加入稀土的植物培養(yǎng)補(bǔ)光燈，一盞燈的亮度和強(qiáng)度相當(dāng)于兩盞日光燈。經(jīng)過(guò)實(shí)驗(yàn)，這種燈下培養(yǎng)的植物葉片或莖中的色素形成充分，對(duì)植物生長(zhǎng)有利，值得推廣。另外，可以節(jié)約一倍多的能源，不但降低散熱，也可減少空調(diào)的工作強(qiáng)度，從而大大降低培養(yǎng)成本。
培養(yǎng)室大多采取晝夜恒溫培養(yǎng)，其溫度為25℃±2℃，也有采取晝夜變溫培養(yǎng)的，夜晚溫度可低些，這應(yīng)根據(jù)花卉生長(zhǎng)需要而定。每天燈光照明12至16小時(shí)。
5.壯苗生根增殖繁殖所得到的不定芽，要轉(zhuǎn)移到不含任何激素，或者不含任何細(xì)胞分裂素而只含有一定量生長(zhǎng)素的生根培養(yǎng)基中，經(jīng)誘導(dǎo)生根培養(yǎng)，才能得到完整的組培苗。
6.試管苗煉苗處理及移植（假植）生根苗的移栽是組織培養(yǎng)育苗的重要一環(huán)，只有移栽成活才能達(dá)到快速育苗的目的。
花卉試管苗由人工提供各方面優(yōu)越條件，一般生長(zhǎng)發(fā)育好，根系也多�？墒峭捎跊](méi)掌握其特性，而造成移栽時(shí)成活率不高。
這是因?yàn)�，花卉材料在瓶中處于異養(yǎng)生活狀態(tài)，可以說(shuō)比溫室生長(zhǎng)的花卉還要嬌嫩得多。而突然從瓶中移到土壤讓其過(guò)自養(yǎng)生活，往往由于變化太劇烈而造成損傷甚至死亡。為此，將已生根的瓶苗移出進(jìn)行煉苗，應(yīng)注意調(diào)控光線與溫度。經(jīng)常調(diào)整瓶子位置，使其各個(gè)方向均勻受光。2至3天后，可適當(dāng)旋松瓶蓋，使空氣慢慢進(jìn)入，使瓶苗逐步適應(yīng)自然環(huán)境，增強(qiáng)抗逆力。
將長(zhǎng)到一定大�。�5至6片真葉或苗高4至5厘米）、生有4至5條根的組培苗經(jīng)開(kāi)瓶煉苗后，洗掉苗上的培養(yǎng)基，將其移栽到保水、透氣性好的基質(zhì)或苗床土中。理想的基質(zhì)是蛭石，一般為河沙、蛭石、園土等按一定比例混合而成。移栽后的組培苗前期宜生長(zhǎng)在適溫、適濕的環(huán)境中，逐漸使其適應(yīng)外界環(huán)境。
煉苗7至10天后進(jìn)行移植。移植（假植）前，將瓶苗根部的培養(yǎng)基洗凈，依大小進(jìn)行分級(jí)。將已分級(jí)的瓶苗以溝植或穴植方式植入栽培基質(zhì)中。移植初期的一周內(nèi)，應(yīng)采用塑料薄膜覆蓋和用噴霧器澆定根水等措施，以保持濕度，并遮去50％至60％的陽(yáng)光。試管苗經(jīng)2至3周馴化后，即可移至培養(yǎng)土中。
組培苗由于組織幼嫩，在移植時(shí)易滋生雜菌，造成苗霉?fàn)�或根莖處腐爛，從而導(dǎo)致死亡。因此可在整個(gè)生長(zhǎng)期，每間隔7至10天輪換噴一次殺菌劑，如多菌靈、百菌清、甲基托布津等進(jìn)行預(yù)防，而且可以用0.1％多菌靈洗根，并在種植后用它來(lái)澆透水，以清除雜菌對(duì)首次移栽幼苗的危害。
�。ū景鎴D片由王麗勉提供）
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由生長(zhǎng)點(diǎn)途徑誘導(dǎo)出的菊花小植株
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由菊花葉片的愈傷組織分化出的小植株
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